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本文导读目录：

1、高能预警！Arnold 的生物催化领域的传奇职业生涯；为酶的进化与设计提供深刻启发

2、读完这篇49分的重磅综述，导师都夸我会抓热点！

3、血红素加氧酶分析

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期 刊：ACS Catalysis（IF=13.084）

论文标题：A Continuing Career in Biocatalysis: Frances H. Arnold

通讯作者：Rudi Fasan，S. B. Jennifer Kan，Huimin Zhao(三人共通讯，皆曾为阿诺德学生或博士后)

DNA解悬媒

Frances H. Arnold 教授获得 2018 年诺贝尔化学奖，我们对她在定向进化和生物催化领域的众多贡献表示敬意。Arnold 教授率先开发了工程酶作为生物催化剂的定向进化方法。她高度跨学科的研究不仅为理解酶进化机制提供了基础，而且为开发工业应用可行的酶生物催化剂和生物催化过程提供了基础。在这篇报告中，作者重点介绍了她在过去三十年中在基础定向进化方法的发展及其在具有所需生物催化功能的酶的设计和工程中的应用方面的一些显着贡献。她的工作在催化领域创造了广泛性的模式转变。

早期的酶的定向进化

由于重组 DNA 技术和蛋白质晶体学的进步，1980 年代酶工程的主流思想流派是使用基于结构分析和定点诱变的合理设计方法。阿诺德是最早采用合理设计方法进行酶工程的化学工程师之一。例如，Arnold 小组将合理设计的新金属结合位点引入酶中以提高其稳定性。然而，阿诺德很快意识到合理设计的局限性，这主要是由于我们对酶结构、功能、动力学以及催化机制的了解有限。因此，在 1980 年代后期，受 John Maynard Smith1 和 Manfred Eigen2 早期研究的启发，Arnold 决定探索具有改进稳定性和活性的工程酶的分子进化策略。

在她的开创性工作中，Arnold 使用迭代轮次随机诱变结合筛选将枯草杆菌蛋白酶 E 在 60% 二甲基甲酰胺中的活性提高了 256 倍。这项工作不仅介绍了定向进化，还描述了定向进化实验中的所有关键步骤并且也证明了有益的突变可以逐渐积累，从而使蛋白质功能发生剧烈变化，而且这些有益突变中有许多是出乎意料的。

除了开发新的定向进化工具和策略外，Arnold 课题组还应用它们来解决生物催化领域的一些实际挑战问题。例如，对硝基苄基酯酶进行了改造，具有更高的稳定性以及新的底物特异性和在有机溶剂中的更高活性等等。此外，Arnold 团队设计了一种稳定性显着提高的枯草杆菌蛋白酶 E 突变体，其热稳定性几乎与天然存在的热稳定枯草杆菌蛋白酶、耐热蛋白酶相同，但与耐热蛋白酶相比，它在更广泛的温度范围内具有高活性。

P450 BM3：定向进化的模型酶

细胞色素 P450 丙烷单加氧酶的定向进化

来自巨大芽孢杆菌的长链脂肪酸羟化酶 P450 BM3 经过 13 轮定向进化转化为高效的丙烷单加氧酶 (P450PMO)。 进化的酶在还原酶域中积累了 3 个有益突变，在血红素域中积累了 20 个（黄色，球体模型），其中许多与血红素辅因子（红色，球体模型）相距甚远。丙烷氧化催化效率的改进，野生型 P450 BM3 没有表现出的活性，也涉及底物通路（插入）的重塑和分配。

定向进化实验中的重要经验

P450 BM3 进化为高效的丙烷单加氧酶不仅证明了 P450 对获得新功能的显着可塑性，而且还证明了定向进化在逐步适应酶以去除新功能方面的有效性。 这种“底物漂移”（为小编翻译结果，如有不适请见谅）策略已被证明在各种其他酶和蛋白质的实验室进化中是有效的。

关于蛋白质如何进化的重要经验也来自对沿 P450PMO 谱系的进化中间体的详细表征（图 3A）。这些研究表明，从长链脂肪酸羟化酶 P450BM3 到丙烷单加氧酶 P450PMO 的适应性位移是通过一系列以广泛的底物谱为特征的混杂突变体进行的，这些突变体是根据它们在一系列 C1-C10 烷烃和其他底物上的底物谱确定的。并且，丙烷活性的进一步优化伴随着 P450 对新功能的“重新特化”（图 3B），导致突变体 (P450PMO) 具有以丙烷为中心的非常窄的底物分布，并且对脂肪酸没有活性残留 ，即丧失了酶天然的活性。

一方面，这些实验表明，从专一性酶开始，新底物活性的获得可以通过那些对多种底物的活性适中的“通用”酶进行。另一方面，鉴于在 P450PMO 的整个定向进化过程中没有应用负筛选(反向筛选)，这些研究还表明，单独的正向筛选（即丙烷活性）就足以从一种专一性酶进化出一种“专一性”酶。

P450PMO“故事”还说明了解决定向进化实验中的活性/稳定性权衡的重要性。事实上，P450PMO 进化过程中的某个时刻（图 3A），蛋白质的热稳定对于能够积累额外的有益突变以增强丙烷活性是必要的。这一发现重申了蛋白质稳定性和可进化性之间的重要关系。

基于结构的重组定向进化酶

Arnold 课题组对研究突变事件对新功能出现的影响的兴趣也扩展到了重组上，这是一种发生在天然蛋白质进化背景下的关键机制。尤其是，他们课题组引入了一种通过同源酶重组进行定向进化的新策略，称为 SCHEMA，它依赖于基于结构的交叉点识别，以最大限度地减少所得嵌合体的结构破坏。使用 β-内酰胺酶支架作为实验载体，通过同源 β-内酰胺酶 TEM-1 和 PSE-2 的 SCHEMA 引导重组生成大量嵌合蛋白，并分析其功能保留（图 4A）。这项研究表明，重组是保守的（比随机诱变更保守），尽管与亲本酶相比引入了很多个氨基酸突变，但仍会生成更多可能性的结构和功能差异的突变体（图 4B）。

为了解决这些突变变化是否与获得新的功能性状具相关性的问题，他们使用 P450 BM3 的三个同源酶进行了类似的重组实验，这些同源酶具有约 65% 的序列同一性。这个过程产生了一个由6000个嵌合P450酶组成的新的家族，平均携带70个突变，其中大约一半正确折叠，其中三分之一显示酶活性。这些嵌合 P450 的表征表明，这些文库的功能性成员获得了显着的功能多样性，包括催化模板酶不能催化底物的能力。此外，发现一部分嵌合 P450 与亲本蛋白相比表现出更高的稳定性（图 4C），并且基于结构稳定性相关性，可以通过稳定片段的靶向重组产生高度热稳定的突变体。总的来说，这些研究有助于证明基于结构的重组作为指导酶功能空间策略的价值，并为进一步的功能进化提供有意义的起点。

实验室进化P450酶的生物催化氧化

氧化催化剂是各种合成应用的宝贵工具，阿诺德和许多专家并没有忽视细胞色素 P450 在这方面的合成潜力。尤其是，Arnold 团队证明了在烷烃氧化酶进化过程中分离的底物混杂 P450 BM3 变体如何可用于 C6-C10 烷烃在亚末端 (ω-1) 位置的选择性羟基化、末端 C5-C8 烯烃的环氧化（Scheme 1A）72 和 2-芳基乙酸酯的 α-羟基化得到有价值的扁桃酸衍生物（Scheme 1B)。

Scheme 1

其另一项贡献表明，P450 催化的羟基化可以与化学氟化相结合，从而能够在各种目标小分子药物和构建块中快速和位点选择性地安装一个或多个氟取代基。由于工程化细菌 P450 靶向的C-H位点通常与人类肝脏 P450 氧化的那些位点重叠，因此该策略对于提高药物或其他生物活性分子的代谢稳定性很有价值。

新于自然(New-to-Nature)的酶的进化

Scheme 2.工程血红素蛋白催化的New-to-Nature转化

(A) 抗抑郁药左旋米那普仑的环丙烷核心的合成；(B) 由一组工程细胞色素 P411 蛋白和珠蛋白催化的辛烯的酶促立体发散环丙烷化

高应变碳环

Scheme 3.细胞色素 P411BM3 催化的

双环丁烷化和环丙烯化

新化学键

Scheme 4.工程 R. marinus 细胞色素 c

催化碳-硅 和碳-硼键形成

C−H 功能化

Scheme 5.通过酶促氮烯和卡宾转移 C-H 插入

实现的 C-H 功能化

(A) 通过分子内氮烯插入苄基 C-H 键的区域选择性环化；(B) 通过 P411BM3 催化的分子内 C-H 酰胺化合成 β-、γ-和 δ-内酰胺；(C) P411BM3 催化的分子间 C-H 胺化；(D) P411BM3 催化的分子间 C−H 烷基化

Frances Arnold 开创了酶工程定向进化的发展。她的传奇的职业生涯在酶工程和生物催化领域产生了深远的影响。这篇文章回顾了她在过去三十年取得的一些鼓舞人心的成就，我们相信，凭借她对卓越研究的无所畏惧和孜孜不倦追求态度，在未来几年内将有更多开创性的贡献。

往期精彩速递诺奖得主阿诺德团队Nature—通过铁-催化的sp3 C-H功能化的酶法组装碳-碳键Nature催化—重组装天然催化结构域构建模拟甲烷单加氧酶ACS Catalysis封面—核废料和生物催化：可持续的联系？Nature催化—重组装天然催化结构域构建模拟甲烷单加氧酶Nature——基于非经典有机催化机理的酶的设计与进化Nature子刊—USP25酶的四级结构四聚体的组装抑制其去泛素化活性ACS Catalysis-酶的水合作用决定有机助溶剂耐受性

参考文献：

1. Smith, J. M. Natural Selection and the Concept of a ProteinSpace. Nature 1970, 225, 563−564.

2. Eigen, M.; Gardiner, W. Evolutionary Molecular EngineeringBased on RNA Replication. Pure Appl. Chem. 1984, 56, 967−978.

3. Giver, L.; Gershenson, A.; Freskgard, P. O.; Arnold, F. H.Directed evolution of a thermostable esterase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 1998, 95, 12809−12813.

4. Moore, J. C.; Arnold, F. H. Directed evolution of a paranitrobenzyl esterase for aqueous-organic solvents. Nat. Biotechnol.1996, 14, 458−467.

5. Zhao, H. M.; Arnold, F. H. Directed evolution convertssubtilisin E into a functional equivalent of thermitase. Protein Eng.,Des. Sel. 1999, 12, 47−53.

文案：DNA解悬媒

原文链接：

https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acscatal.9b02737（或点击阅读原文）

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您的“点赞”+“在看”是对我们最大的鼓励！　　过去十年，科研人员通过对“铁死亡”（Ferroptosis）不断地探索和研究，涌现出了许多里程碑式的发现。尤其在心血管疾病多种实验模型中，关于铁死亡的分子和代谢调控机制研究取得了令人振奋的进展，已成为公认的具有极大潜力的新靶点。但如何将这些进展转化为切实有效的临床预防方法，还是一个极大的挑战。2022年7月，浙江大学医学院的王福俤教授和闵军霞教授团队在Nature Reviews Cardiology（IF=49.421）期刊发表了题为“The Molecular and Metabolic Landscape of Iron and Ferroptosis in Cardiovascular Disease（铁和铁死亡在心血管疾病中的分子与代谢图谱） ”的综述长文。该综述系统总结了铁死亡的代谢调控机制，以及其在心血管疾病中的最新进展，同时提出了靶向铁死亡防治心血管疾病的新策略，并展望了该领域未来的发展方向。

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要点终末分化心肌细胞的死亡是导致多种心血管疾病发展的重要因素。铁死亡作为一种新发现的由铁依赖性脂质过氧化作用驱动的细胞死亡形式，与心血管疾病显著相关。铁死亡涉及各种代谢过程，包括铁、脂质和谷胱甘肽的代谢。体外和体内证据均证明，心肌缺血再灌注损伤、蒽环类药物介导心脏毒性、败血症，从而引起心脏损伤、肥厚型心肌病和糖尿病性心肌病，而铁死亡在这些疾病中起到病理生理学作用。使用特定抑制剂靶向铁死亡可能为以前无法治疗的心血管疾病提供新的治疗机会。

维持铁稳态对于正常的心脏功能至关重要。越来越多的证据表明，铁失衡是许多心血管疾病亚型的共同特征。在过去的 10 年中，铁死亡作为一种具有铁依赖性的可调节性细胞死亡形式，越来越被认为是介导多种心血管疾病的发病和进展的重要机制，包括动脉粥样硬化、药物性心力衰竭、心肌缺血再灌注损伤、败血症引起的心肌病、心律失常和糖尿病心肌病。 因此，深入了解参与调节心肌细胞铁代谢和铁死亡的机制可能会改善疾病管理。这篇综述总结了心血管疾病背景下铁信号的代谢和分子途径与铁死亡之间的关系，还讨论了铁死亡在心血管疾病治疗中的潜在靶点，并描述了这些新治疗靶点的当前局限性和未来方向。各种形式的调节性细胞死亡，如细胞凋亡、坏死性凋亡、细胞焦亡和自噬，都与心血管疾病的发病机制有关。在过去的10年中，越来越多的研究支持这样一种观点，即铁死亡（一种铁依赖性的、涉及脂质氢过氧化物积累的非凋亡性细胞死亡形式）在包括阿霉素所致心肌病、心肌缺血再灌注损伤、心肌梗死和心力衰竭等在内的心血管疾病发展中具有病理生理学作用。 作为几乎存在于所有生命形式中的必需微量元素，铁参与了许多生物过程，包括能量代谢和核苷酸合成及修复。对人类来说，缺铁是最常见的营养不良相关疾病，影响了多达75%的心力衰竭患者。相反，原发和继发性的铁过载均可通过氧化损伤导致心脏疾病，但这一过程的确切机制尚不清楚。研究显示心肌细胞中过量的铁会通过细胞膜中磷脂氢过氧化物的积累直接诱导铁死亡。 除了改变铁稳态外，活性氧（ROS）或活性氮的过量产生也可以通过催化细胞膜中磷脂的氧化直接诱导心肌细胞的铁死亡。事实上，氧化应激已被证实与心血管疾病的发展有关；在动物模型中，针对调控细胞防御氧化应激的分子和代谢途径——尤其是谷胱甘肽依赖性抗氧化系统——已被证明可以预防心肌病。 目前的证据表明，有多种心血管疾病的发展是由铁死亡驱动的。例如，由不同信号和代谢途径介导的高水平铁死亡可导致缺血性心脏病、心脏损伤、心力衰竭和心肌病。这篇综述总结了心肌细胞中铁稳态的调节、谷胱甘肽合成和脂质代谢的机制；讨论了新发现的心脏病中铁死亡的推定靶点；并对针对心脏铁死亡的新临床疗法的潜力提出了一些批判性观点。

铁死亡的发现

尽管2012年才首次报道了铁死亡作为一种新的、可以被铁螯合剂去铁胺抑制的细胞死亡形式，但其实几十年来涉及铁和氧化应激的各种形式细胞死亡已经广为人知。铁死亡的概念可能源自于我们对半胱氨酸消耗诱导下癌细胞死亡和谷氨酸诱导下细胞毒性的了解。有趣的是，早在2001年就有研究者在神经元研究中首次报道了氧化性死亡，其特征是氧化应激诱导的非凋亡和非兴奋性毒性途径促进谷氨酸诱导的细胞死亡，尽管在当时其基本机制仍然很大程度上是未知的。自最初发现以来，铁死亡就被定义为一种铁依赖性的可调节细胞死亡形式，与铁催化的致死性脂质过氧化物积累有关。

铁死亡的分子和代谢驱动因素

发生铁死亡的细胞具有不同于其他已知死亡形式（包括细胞凋亡、坏死性凋亡和细胞焦亡在内）的细胞遗传、生化、形态和代谢特征。有趣的是，与迄今为止发现的其他形式细胞死亡不同，铁死亡可以波状的方式在细胞群中快速传播。在形态学变化方面，发生铁死亡的细胞在电镜下可观察到的线粒体异常，包括肿胀、密度变化和外膜破裂。最后，参与铁、谷胱甘肽和脂质代谢的途径可联合起来控制铁死亡的发生和执行，特别是在心肌细胞中（图1）。下面将讨论这些代谢途径在介导铁死亡和心血管疾病中的作用。

图1. 铁死亡相关代谢通路。

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在细胞水平上，铁死亡主要由铁依赖性脂质过氧化驱动。铁代谢的许多方面，如铁的吸收、储存和利用，在调节铁死亡中具有重要作用。此外，脂质代谢途径中长链脂肪酸 CoA 连接酶 4 (LACS4)、溶血磷脂酰基转移酶 5 (LPLAT5)、脂氧合酶 (LOX) 或 NADPH 氧化酶 (NOX) 的激活促进了脂质过氧化和铁死亡。典型的铁死亡-抑制途径涉及通过胱氨酸-谷氨酸逆向转运蛋白（Xc-系统）摄取胱氨酸（Cys），从而促成谷胱甘肽（GSH）的生物合成。使用 GSH 作为辅助因子，谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）将磷脂氢过氧化物还原为相应的醇。磷脂的过氧化也受到铁死亡抑制蛋白1 (FSP1)–辅酶Q10（CoQ10）系统的控制。铁死亡也受铁代谢途径的调节，该途径涉及铁的吸收、转运、储存和利用。在细胞水平上，非血红素铁可以通过转铁蛋白受体蛋白 1 (TFR1) 介导、转铁蛋白（TF）结合铁摄取或金属转运蛋白溶质载体家族39成员14（SLC39A14；也称为金属阳离子同传者ZIP14）介导的非TF结合的铁摄取运输进细胞内。此外，血红素降解和核受体共激动剂4（NCOA4）介导的铁蛋白吞噬可以增加不稳定铁池（LIP），从而通过Fenton反应使细胞对铁死亡敏感。FPN，ferroportin 铁转运蛋白；Glu, glutamate 谷氨酸；GSSG，glutathione disulfide 谷胱甘肽二硫化物；HO1，haem oxygenase 1 血红素加氧酶1；KEAP1，Kelch-like ECH-associated protein 1 Kelch样ECH相关蛋白1；ML1，mucolipin 1 粘磷脂1；NRAMP2，natural resistance-associated macrophage protein 2 天然抗性相关巨噬细胞蛋白2；NRF2，nuclear factor-erythroid 2-related factor 2 核因子-红细胞2相关因子2；PUFA，polyunsaturated fatty acid 多不饱和脂肪酸；PUFA–CoA，coenzyme A-activated polyunsaturated fatty acid 辅酶 A 激活的多不饱和脂肪酸；PUFA-PL，polyunsaturated fatty acid-containing phospholipid 含多不饱和脂肪酸的磷脂；RNF217，E3 ubiquitin protein ligase RNF217 E3泛素蛋白连接酶RNF217；STEAP3，metalloreductase STEAP3 金属还原酶STEAP3。

心脏中的铁代谢和铁死亡

心血管系统中铁稳态的调节铁的细胞摄取是由结合铁的转铁蛋白（包含两个三价铁分子）与其受体（转铁蛋白受体蛋白1，TFR1）的结合介导的，这会触发整个饱和复合物的网格蛋白依赖性内吞作用。然后内含体被囊泡ATP酶酸化，导致STEAP（前列腺六跨膜上皮抗原）金属还原酶家族将三价铁还原为二价铁，随后二价铁通过天然抗性相关巨噬细胞蛋白2（NRAMP2；亦称DMT1）从内体释放到细胞质中，脱铁转铁蛋白和TFR1则转回细胞表面以供细胞重复利用。心脏中缺乏Tfr1的小鼠会罹患严重的心肌病并伴有心脏铁缺乏，并在生命的第二周死亡。非转铁蛋白结合铁被认为是通过电压依赖性钙通道转运到心肌细胞中的，但2021年发表的一项研究对钙通道在介导心脏对非转铁蛋白结合铁的摄取中的作用提出了质疑。在细胞质中，亚铁被细胞质铁蛋白氧化成铁态，生成的铁蛋白结合铁可以降解用于酶促反应或储存以备后用。铁饱和铁蛋白被核受体共激活因子4(NCOA4) 介导的自噬（一个称为铁蛋白吞噬的过程）降解，导致溶酶体铁蛋白降解，随后释放其铁内容物并将其通过溶酶体 NRAMP2输出到细胞质。Fth1（编码铁蛋白重链）的心脏特异性缺失会导致心脏中的铁失调和氧化应激增加，从而导致对铁过载诱导的组织损伤的易感性增加。相反，小鼠心脏中Ncoa4 的缺失改善了心脏功能并减少了由压力过载引起的铁蛋白吞噬介导的铁蛋白降解。铁转运蛋白是脊椎动物细胞中唯一已知的铁转出通道，有研究者在早期心肌细胞特异性缺失编码铁转运蛋白(Fpn)的基因的小鼠中观察到心脏铁过载、心脏功能受损和寿命的缩短。铁调素是一种主要在肝脏中合成的肽激素，它通过E3泛素蛋白连接酶RNF217介导的在肠道和脾脏中的泛素化抑制铁转运蛋白，从而分别调节铁的吸收和回收。遗传性铁调素缺乏会导致小鼠和人类出现最严重的全身性铁超负荷。然而，心肌细胞中铁调素的特异性缺失会导致心脏因缺铁产生致命的心肌病，这说明了铁调素-铁转运蛋白轴在心脏铁稳态中的细胞自主作用（图2a）。

图2. 心脏铁和血红素代谢调节铁死亡。心肌细胞中的铁摄取依赖于与其受体转铁蛋白受体蛋白1（TFR1）结合的二铁转铁蛋白（TF）的内吞作用。为了维持细胞质中铁的水平，铁可以从内溶酶体中的TF释放，并在金属还原酶 STEAP3 介导的还原反应后通过天然抗性相关巨噬细胞蛋白2（NRAMP2）输出到细胞质。过量的铁或与铁蛋白重链（FTH）结合，或通过唯一的铁转出蛋白——铁转运蛋白（FPN）输出。此外，铁可以通过核受体共激活因子4（NCOA4）介导的铁蛋白自噬降解从FTH中释放出来，这一过程称为铁蛋白吞噬。b. Mitoferrin 1（亦称SLC25A37）和mitoferrin 2（亦称SLC25A28）介导铁跨线粒体膜的转运。铁主要用于合成线粒体中的铁硫（Fe-S）簇和血红素。过量的铁可以以线粒体特异的铁蛋白（FTMT）形式储存。FLVCR1B（猫白血病病毒亚组C受体相关蛋白1B）促进血红素流出到细胞质中，而将Fe-S簇转运至细胞质中可能需要铁硫簇转运蛋白ABCB7、线粒体（ABCB7）和ABCB8（亦称线粒体钾通道ATP结合亚基）。Ala, 5-aminolevulinate 5-氨基乙酰丙酸盐; ALAS, aminolevulinic acid synthase 氨基乙酰丙酸合酶; Apo-TF, apo-transferrin 载脂蛋白-转铁蛋白; CO, carbon monoxide 一氧化碳; Cys, cysteine 半胱氨酸; ETC, electron transport chain 电子传输链; HO1, haem oxygenase 1 血红素加氧酶1; Holo-TF, holo-transferrin holo-转铁蛋白; LIP, labile iron pool 不稳定铁池; ML1, mucolipin 1 粘磷脂1; NFS1, cysteine desulfurase, mitochondrial 线粒体半胱氨酸脱硫酶; OXPHOS, oxidative phosphorylation 氧化磷酸化; RNF217, E3 ubiquitin protein ligase RNF217 E3泛素蛋白连接酶RNF217; ROS, reactive oxygen species 活性氧; TCA, tricarboxylic acid 三羧酸。

细胞铁水平由铁调节蛋白1（IRP1）和IRP2在转录后水平调节。这些细胞质蛋白与目标转录体（如TFR1 mRNA）的3'-非翻译区（UTR）结合，从而稳定转录物并提高翻译效率。相比之下，IRP1或IRP2与靶mRNA（如FPN和FTH1）的5'-UTR结合会阻断核糖体进入并阻止它们的翻译。附着在铁硫 (Fe-S) 簇上的Holo-IRP1则发挥胞质乌头酸酶的作用且不能与mRNA分子结合。然而，当细胞铁水平降低时，Fe-S簇从IRP1上解离，然后可以与核糖体进入位点结合。IRP2是处于持续性活跃水平的；然而，当细胞铁水平足够时，IRP2会泛素化并通过一个需要F-box/LRR-重复蛋白5的过程降解。因此，当铁水平足够时，IRP1包含一个Fe-S簇，IRP2被降解，从而抑制IRP系统。当IRP系统在严重缺铁期间无法维持足够的细胞铁水平时，可以激活另一个铁调节途径。该途径被称为“铁保存通路”，不同于由IRP系统介导的“铁获取通路”。在缺铁状态下，mRNA结合蛋白三四脯氨酸的水平会增加，相反的TFR1水平会降低以保存细胞铁。三四脯氨酸通过与CNOT1（CCR4-NOT 转录复合物亚基1）去腺苷酶复合物结合，降解其靶mRNA。在缺铁期间诱导三四脯氨酸对细胞存活至关重要，因为三四脯氨酸缺乏的小鼠会因缺铁而出现心功能不全，而体外三四脯氨酸的消耗会导致细胞在低铁条件下死亡。在心脏中，三四脯氨酸与mRNA转录物结合并导致其降解，这些转录物编码参与多个过程的蛋白质，包括线粒体电子传递链中含有 Fe-S 簇的蛋白质。因此，在缺铁条件下不会合成过多数量的原本会与铁结合的载脂蛋白，从而使得有限量的铁能被必需蛋白质利用。

铁死亡中的铁代谢铁的存在是驱动铁死亡的关键因素。接受高铁饮食喂养的小鼠，以及缺乏血幼蛋白的小鼠和缺乏SMAD家族成员4缺乏的小鼠，会患有严重的铁过载和更高的肝脏铁死亡风险。相比之下，缺乏Hfe（编码遗传性血色素沉着病蛋白同源物）的小鼠只有中度铁过载，而没有肝铁死亡。值得注意的是，积累的细胞铁（尤其是不稳定的亚铁离子）可以直接与细胞氧化剂反应，通过Fenton反应产生细胞毒性羟基自由基，进而促进铁死亡。相比之下，游离离子铁与转铁蛋白或铁蛋白等蛋白质的结合可以对Fenton反应和铁死亡具有保护作用。此外，脂氧合酶通过磷酸化酶激酶 G2 依赖性铁池对多不饱和脂肪酸 (PUFA) 进行过氧化是引发铁死亡的必要条件。因此，许多参与调节细胞铁稳态的蛋白质会影响细胞对铁死亡的敏感性（表1）。

表1. 与铁死亡相关的铁代谢的主要调节剂

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通过TFR1、溶质载体家族39成员14（SLC39A14；也称为金属阳离子转运体ZIP14）和/或NRAMP2对铁的吸收，可以确定细胞对铁死亡的敏感性。细胞溶质铁蛋白通过对铁含量的控制赋予对铁死亡的抵抗力；因此，通过NCOA4对铁蛋白的选择性自噬可以增加细胞对铁死亡的易感性。铁伴侣多聚结合蛋白1（PCBP1）与铁蛋白结合并将Fe2+传递给铁蛋白。此外，敲除Pcbp1的小鼠肝细胞增加了不稳定铁和脂质过氧化的水平，这表明PCBP1可能在预防铁死亡相关疾病中起关键作用。相比之下，降低铁或铁蛋白转出蛋白（如ferroportin和prominin 2）的表达已被证明会促进铁死亡。铜蓝蛋白通过其亚铁氧化物酶活性帮助铁转运蛋白离开细胞，铜蓝蛋白的缺失促进了erastin诱导的和转录因子RSL3诱导的铁死亡，而铜蓝蛋白的过表达抑制了肿瘤细胞中的铁死亡。维持线粒体铁稳态在预防铁死亡方面也具有重要作用。Mitoferrin 1（也称为SLC25A37）和mitoferrin 2（也称为SLC25A28）是参与血红素和Fe-S生物合成的关键线粒体铁转入蛋白。mitoferrin 2的缺失会减少erastin诱导的细胞死亡，而mitoferrin 2的过表达会增加铁死亡。血红素加氧酶1（HO1）是一种线粒体酶，可催化血红素降解产生亚铁离子，其激活会导致线粒体铁过载并在体外和体内增加铁死亡。然而，HO1的轻度上调实际上可能具有细胞保护作用。与细胞溶质铁蛋白一样，线粒体铁蛋白对铁死亡具有保护作用。例如，果蝇和过表达线粒体铁蛋白的细胞对erastin诱导的铁死亡有抵抗力。几种Fe-S蛋白在铁死亡过程中的脂质过氧化中发挥作用。例如，抑制NFS1（线粒体半胱氨酸脱硫酶，使用半胱氨酸中的硫合成Fe-S簇）会使癌细胞对铁死亡敏感。此外，已有研究表明Fe-S结合蛋白mitoNEET（也称为CISD1）和NAF1（也称为CISD2）参与线粒体铁转运，增加癌细胞对ROS诱导的细胞死亡的耐受性。mitoNEET表达的增加阻止了人类肝细胞癌细胞中erastin诱导的铁死亡，并且NAF1过表达同样赋予了小鼠肿瘤异种移植模型对柳氮磺胺吡啶诱导的铁死亡的抗性。

铁过载相关的心脏疾病当身体储存过量的铁时，就会发生铁过载。心脏特别容易受到铁积累引起的损伤。前文已描述两种一般类型的铁过载。原发性铁过载是由导致膳食铁吸收失调的遗传病引起的，而继发性铁过载是由于反复输血、药物引起的毒性或铁的过量摄入而引起的。然而，鉴于缺乏用于测量铁死亡的可靠生物标志物，我们对铁死亡与这些疾病之间的联系仍然知之甚少。遗传性血色素沉着病是白人人群中最常见的遗传病之一。影响铁调节肽铁调素的产生或功能的一系列突变，可导致包括心脏在内的许多器官不同程度的铁过载。因此，心力衰竭是遗传性血色素沉着病患者的一个常见并发症，并且在青少年型患者中更为普遍。HFE（编码遗传性血色素沉着病蛋白）中C282Y突变的携带者发生急性心肌梗死和心血管死亡的风险高于非携带者。同样地，遗传性血色素沉着病患者的血管内皮功能受损和血管内膜中层厚度增加与铁状态改变有关；因此铁耗竭疗法可以降低这些患者发生心血管事件的风险。Friedreich共济失调是一种常染色体隐性遗传的神经退行性疾病，会同时影响神经系统和非神经组织，包括心脏和胰腺。Friedreich共济失调是由FXN基因第一个内含子中GAA三联体重复序列的纯合扩增引起的，该基因编码蛋白质frataxin（也称为线粒体frataxin）。Frataxin对线粒体功能至关重要，因为它在Fe-S簇的生物发生和抗氧化防御中发挥作用。Frataxin缺乏会导致线粒体铁积累、过量产生ROS和增加脂质过氧化，从而导致Friedreich共济失调的发生。除了典型的神经系统症状外，Friedreich共济失调的临床表现还包括严重的心肌病，这是这些患者最常见的死亡原因。鉴于心脏和大脑含有大量线粒体，严重的神经和心脏症状是可以预料到的。有趣的是，由于Tfr1表达的显着变化和从细胞质到线粒体的铁转运的改变，具有心肌细胞特异性Fxn缺失的小鼠心脏的线粒体铁增加。用铁螯合剂去铁酮和辅酶Q10类似物艾地苯醌联合治疗Friedreich共济失调患者可减轻心脏肥大。其他研究也表明，去铁酮治疗可以改善心脏功能，但不能改善神经系统症状。然而，铁螯合的临床获益目前尚不清楚，有待进行长期、大规模的试验。

无效的红细胞生成和输血引起的铁过载铁过载是地中海贫血患者的常见并发症，这是一组因血红蛋白合成受损引起的遗传性疾病。无效的红细胞生成，即红细胞生成的增加与成熟红细胞的相应增加不匹配，是器官中铁过载的主要原因。此外，重复输血是一种常见的地中海贫血治疗方法，也是导致铁过载的另一个过量铁的来源。铁过载也可导致心肌病，这是地中海贫血患者发病和死亡的主要原因。尽管地中海贫血相关心肌病的临床表现多变且复杂，但大多数患者都会出现左心衰和射血分数降低；另一个主要症状是心律失常，可直接导致心源性猝死。为了控制铁过载的有害影响，螯合疗法在 1970 年代首次用于治疗与铁过载有关的地中海贫血相关心肌病的患者；今天，全球公认铁螯合是治疗这种疾病的最有效方法。无效的红细胞生成和输血引起的铁过载也可能由其他遗传性血液疾病引起，例如镰状细胞病（下文讨论）、骨髓增生异常综合征、纯红细胞再生障碍和白血病。通过更精确地监测组织铁水平、开发新的铁螯合剂和调节铁调素水平以减少铁负荷和心脏毒性，可以加强对铁过载引起的心脏疾病的管理。

蒽环类药物引起的心脏毒性自1960年代后期以来，蒽环类药物——包括阿霉素、柔红霉素、表柔比星和伊达比星在内的一类药物——已被广泛用于治疗乳腺癌、白血病和许多其他类型的恶性肿瘤。尽管蒽环类药物具有强大的抗癌作用，但由于存在导致心脏毒性的风险，其临床应用受到了严重限制。事实上，超过25%的患者在接受550mg/m2的阿霉素累积剂量后发生了充血性心力衰竭。尽管阿霉素诱发心肌病的机制尚不清楚，但越来越多的证据表明该疾病涉及了包括铁超负荷在内的一些危险因素。由高铁饮食或基因改造介导的小鼠全身铁积累显着增加了对阿霉素诱导的心脏毒性的敏感性。相反地，与对照组小鼠相比，缺铁饮食喂养的小鼠发生多柔比星引起的心脏毒性风险更低，存活率更高，这表明靶向调节心脏铁水平的代谢途径可能是临床治疗化疗相关心肌病的有效策略。关于阿霉素如何影响心脏中的铁代谢，有研究发现，由于线粒体铁输出蛋白 ABCB8（亦称线粒体钾通道 ATP 结合亚基）的抑制，铁在阿霉素治疗的心肌细胞线粒体中会特异性积累。ABCB8的过表达或使用右雷佐生直接螯合线粒体铁可防止多柔比星诱导的心脏毒性。此外，小鼠中的阿霉素治疗已被证明可诱导心脏线粒体铁蛋白表达，线粒体铁蛋白的遗传缺失增加了心肌细胞对阿霉素诱导的铁毒性的敏感性。使用RNA测序（RNA-seq）分析，结果表明，在多柔比星诱导的小鼠心肌病期间，HO1通过核因子红细胞2相关因子2（NRF2）的激活上调，来导致血红素降解和线粒体中游离铁的释放。此外，我们发现用竞争性HO1抑制剂锌原卟啉IX治疗小鼠可以防止多柔比星诱导的心肌病。2021年发表的一项研究发现，E3泛素蛋白连接酶TRIM21负调节NRF2介导的抗氧化途径，并且Trim21敲除小鼠可免受阿霉素诱导的心脏毒性和死亡。应进行更多检查这些化合物及其分子靶标的临床适用性的研究，以改进旨在减少蒽环类药物引起的心脏损伤的治疗策略。膳食铁超负荷在典型的人类饮食中，两种形式的铁（血红素铁和非血红素铁）来自不同的饮食来源，具有不同的吸收机制和代谢途径。血红素铁约占典型饮食总铁摄入量的15%，仅存在于红肉、鱼和家禽的血红蛋白和肌红蛋白中，而非血红素铁则存在于谷物、水果和蔬菜中。鉴于血红素铁结合并被保护在卟啉复合物中，其吸收率比非血红素铁高5到10倍。迄今为止，一些基于人群的研究评估了膳食铁摄入量与心脏病风险之间假定关联，却发现了不一致的结果（表2）。尽管如此，这些前瞻性队列研究的荟萃分析表明，无论非血红素铁摄入量如何，膳食血红素铁的高摄入量与普通人群心脏病和心血管死亡风险的增加显着相关。因此，减少摄入高血红素铁的食物可能有助于预防心脏病。

表2. 心血管疾病膳食铁摄入量的前瞻性队列研究。CHD, coronary heart disease冠心病；CVD, cardiovascular disease 心血管疾病；MI, myocardial infarction 心肌梗死。

谷胱甘肽代谢和心脏铁死亡

除了铁代谢外，半胱氨酸或半胱氨酸缺乏、谷胱甘肽消耗和磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶 4 (GPX4) 的失活也被证明会促进铁死亡。主要的抗氧化剂谷胱甘肽主要在肝脏中产生，是由氨基酸半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸组成的三肽。在这三种氨基酸中，半胱氨酸是谷胱甘肽合成的限速前体。尽管细胞内半胱氨酸可以通过从头生物合成或蛋白质分解代谢产生，但大多数细胞主要从胱氨酸-谷氨酸逆向转运系统xc-（亦称xCT）获得半胱氨酸，该系统由溶质载体家族7A成员11亚基（SLC7A11；亦称胱氨酸-谷氨酸转运蛋白）和SLC3A2亚基（亦称4F2HC）组成。SLC7A11亚基包含12个跨膜结构域，主要介导蛋白质复合物的转运蛋白活性，而SLC3A2是一种伴侣蛋白，有助于稳定SLC7A11并确保复合物的膜定位恰当。系统xc-以 1:1 的比例转出细胞内谷氨酸和转入细胞外胱氨酸；然后通过消耗NADPH的还原反应将新导入胞质溶胶中的的胱氨酸转化为半胱氨酸。2020年发现的人体系统xc-的结构清楚地表明了两个亚基在细胞外界面和跨膜区域的相互作用。此外，在SCL7A11的细胞内前庭中发现了可清晰分辨的非蛋白质密度，erastin分子可以与其结合。因此，对erastin或其类似物系统xc-的抑制可导致细胞内谷胱甘肽的消耗并引发铁死亡，这为我们提供了一个抗肿瘤治疗的潜在可行策略。在细胞应激条件下，SLC7A11的表达受转录因子NRF2的正向调节。此外，有研究显示NRF2的遗传缺失和KEAP1（Kelch样ECH相关蛋白1，与NRF2结合并促进其泛素化和蛋白酶体降解）的过表达均会促进癌细胞的铁死亡。值得注意的是，KEAP1-NRF2轴会调节许多涉及谷胱甘肽生物合成和铁代谢的基因，这也可以影响细胞对铁死亡的易感性。相反，肿瘤抑制蛋白p53抑制SLC7A11转录，从而促进铁死亡。cAMP依赖性转录因子ATF3也已被证明通过与SLC7A11启动子结合并以不依赖p53的方式抑制其表达，来促进铁死亡。此外，我们团队的研究也表明，在心肌细胞中选择性过表达Slc7a11会增加细胞谷胱甘肽水平并防止铁蛋白H缺乏介导的心脏铁死亡，这为SLC7A11在心脏中具有抗铁死亡作用提供了第一个证据。此外，敲除Slc7a11会加重小鼠的心脏肥大和功能障碍，这两种情况都可以通过抑制铁死亡来逆转。GPX4酶与作为必需辅因子的谷胱甘肽一起清除铁依赖性脂质过氧化的有害副产物，从而保护细胞膜免受损伤。通过使用化学蛋白质组学分析，研究人员已确定GPX4在癌细胞中的过表达可以抑制由转录因子RSL3介导的铁死亡，而GPX4的缺失会增加对铁死亡的敏感性。GPX4是一种硒蛋白，其合成和活性受必需微量元素硒的浓度影响。硒是GPX4功能所必需的，补充硒可以增加GPX4的表达并保护细胞免受铁死亡。有趣的是，人类硒缺乏被认为会导致克山病，这是一种发生在中国克山地区的儿童和孕妇的地方性心肌病，该地区食物中的硒含量较低；克山病会进展为扩张型心肌病和心力衰竭。在一项基于人群的队列研究中，高血清硒水平也与死亡率降低和新发心力衰竭病例的减少独立相关。因此，有必要进行旨在进一步评估高硒水平对人体潜在益处的有效干预研究。鉴于谷胱甘肽的众多生理功能，其在心脏病发病机制和发展中的作用可想而知。一项基于日本人群的研究发现，所有心脏病患者的血浆谷胱甘肽水平显着低于健康对照组。在随后的一项研究中，无症状心脏病患者和有症状心脏病患者的循环谷胱甘肽水平分别降低了21%和40%。重要的是，研究人员测量了心房组织中的谷胱甘肽浓度后，还发现了心脏谷胱甘肽缺乏与心脏病密切相关的直接证据。此外，在高血压患者中也观察到了谷胱甘肽的缺乏。缺乏糖蛋白载脂蛋白E（apoE，除LDL以外的所有脂蛋白的组成部分）的小鼠是最常用的动脉粥样硬化前临床模型。与年龄匹配的野生型对照相比，雄性apoE缺陷小鼠易发生动脉粥样硬化的主动脉弓中谷胱甘肽水平显着降低。研究人员提出，谷胱甘肽缺乏是这些动物细胞内抗氧化防御抑制的核心，因此在动脉粥样硬化的发病机制中具有一定作用，这一有趣的假设得到了后续研究结果的支持。例如，脂质体包被的谷胱甘肽可显著降低氧化应激，与脂质过氧化物或氧化的LDL140的水平降低相关。此外，其他研究表明，在富含饱和脂肪饮食喂养的小鼠中，谷胱甘肽水平的升高会显着降低肝脏和血浆胆固醇水平。由于心脏具有非常高的能量需求并且特别容易受到氧化损伤，心肌细胞被认为需要专门的增强抗氧化系统来避免铁死亡。尽管目前尚缺乏铁死亡与人类心脏病有关的直接证据，但经过铁死亡相关基因（如SLC7A11和GPX4）改造的心肌细胞特异性动物疾病模型以及动物模型中，关于铁死亡诱导剂或抑制剂的研究提供了令人信服的前临床证据表明谷胱甘肽通路对心脏铁死亡具有保护作用。

心脏中的脂质代谢和铁死亡

在哺乳动物细胞中，细胞膜中含有PUFA的磷脂发生过氧化是铁死亡的重要步骤。长链脂肪酸CoA连接酶4（LACS4）将PUFA转化为酰化形式，并被认为是铁死亡的特定驱动因素，因为其上调会增加磷脂中的PUFA含量并使细胞更容易发生铁死亡。尽管尚未对LACS4在心肌中的作用进行深入研究，但LACS4已被证明是限制骨骼肌细胞死亡和预防横纹肌溶解的新治疗靶点。相比之下，LACS3催化外源性单不饱和脂肪酸转化为脂肪酰基辅酶A，从而取代PUFA并抑制铁死亡。相反，溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3催化这些酰化的PUFA插入膜磷脂；因此，去除这种酶会增加细胞对铁死亡的抵抗力。脂氧合酶是一类含铁酶，直接氧化细胞膜中的PUFA和含PUFA脂质。脂氧合酶被认为在脂质过氧化和铁死亡中具有重要作用。此外，抑制蛋白激酶级联反应的支架蛋白磷脂酰乙醇胺结合蛋白1已被证明可与15-脂氧合酶结合并引导其至膜内的PUFA，从而促进铁死亡。心脏对氧化损伤高度敏感，脂质过氧化是ROS诱导心脏损伤的重要原因。心脏组织有几种潜在的内源性ROS来源，包括线粒体电子传递链、NADPH氧化酶、黄嘌呤氧化还原酶、一氧化氮合酶和细胞色素P450。此外，一些外源性因素和化学物质也会导致氧化损伤。源自含PUFA的膜磷脂氧化的脂质过氧化物的累积表明，抗氧化系统不能始终有效地平衡ROS的产生；因此，脂质过氧化是心脏氧化应激最明显的表现之一。亲电活性醛，如丙二醛、4-羟基己烯醛和 4-羟基壬烯醛，是PUFA氧化的主要终产物，通常用作脂质过氧化的标志物。在一项为期1年的随访研究中，发现慢性心力衰竭患者的高血清丙二醛水平是死亡的独立预测因素和综合临床终点。这些结果与之前的研究结果一致，并支持脂质过氧化在心脏病的发展和严重程度中都有作用的假设。值得注意的是，脂质过氧化通过其对细胞膜破坏的影响是铁死亡的驱动因素。脂质过氧化物的清除可防止脂质过氧化诱导的心肌细胞膜结构损伤，并抑制铁死亡。

线粒体和心脏铁死亡

作为真核细胞中的能量源，线粒体协调很多重要的代谢过程，如氧化磷酸化。鉴于血红素和Fe-S簇的产生主要发生在线粒体中，该细胞器含有大量的铁（图2b）。铁通过在红细胞谱系中表达的线粒体铁蛋白1和普遍表达的线粒体铁蛋白2被线粒体吸收。线粒体铁与线粒体铁蛋白（一种由FTMT编码的氧化铁酶）结合以阻止ROS的产生，线粒体铁蛋白的突变可导致线粒体铁过载和细胞质铁缺乏。铁从线粒体输出的机制目前尚不清楚；输出的线粒体铁是与谷胱甘肽结合还是与Fe-S簇或血红素分子结合亦尚不清楚。心脏中线粒体蛋白ABCB8的选择性缺失已被证明会导致线粒体铁过载、ROS产生的增加、胞质Fe-S簇的成熟缺陷以及心肌病。此外，铁硫簇转运蛋白ABCB7，线粒体（ABCB7）在线粒体铁稳态中起作用，ATP结合盒亚家族B成员10，线粒体（ABCB10）已被证明可以调节线粒体中血红素合成的早期步骤，并且可以还从线粒体中转运出胆绿素。在线粒体中，铁也用于合成血红素，血红素是介导催化和电子转移的辅助因子。血红素的生产是一个多步骤过程，需要八种不同的酶，其中氨基乙酰丙酸合酶 (ALAS；也称为 ALAS-H) 参与限速反应的第一步。过量的血红素要么通过猫白血病病毒亚组 C 受体相关蛋白 1B (FLVCR1B) 输出到细胞质，要么通过 HO1 途径分解代谢成等摩尔量的 Fe2+、CO 和胆绿素。HO1 表达普遍通过氧化应激诱导产生，而 HO2则是持续表达而非可诱导性的。在哺乳动物中，血红素排出主要通过质膜输出蛋白 FLVCR1A170 介导。相反，FLVCR2 已被确定为质膜血红素输入相关。其他血红素转运蛋白，如血红素转运蛋白 HRG1 和 ATP 结合盒亚科 C 成员 5（ABCC5；也称为 MRP5）被认为可以从各种细胞器中传递血红素，但目前对其功能知之甚少。鉴于线粒体呼吸链是大多数哺乳动物细胞中 ROS 的主要来源，自 2012 年发现铁死亡以来，人们一直假设线粒体在调节 erastin 诱导的细胞死亡中起核心作用。使用透射电子显微镜可观察到铁死亡细胞，包括减少的线粒体体积和增加的线粒体膜密度。此外，某些基于氮氧化物的脂质过氧化缓解剂已被设计用于特异性靶向线粒体，并能防止erastin 诱导和RSL3 诱导的铁死亡。相比之下，也有一些研究提供了不支持线粒体与铁死亡之间联系的证据。例如，一份早期报告表明，线粒体 DNA 耗尽的癌细胞系对铁死亡敏感性与其亲代细胞系相似。随后的一项研究表明，线粒体缺陷细胞仍然可以发生铁死亡，并且可以通过使用铁抑素和铁螯合剂治疗来抑制这类铁死亡。但这些发现仍值得商榷。在另一项研究中，半胱氨酸消耗可介导线粒体膜的超极化并促进脂质过氧化物的积累，而抑制三羧酸循环或电子传递链则可抑制线粒体铁死亡。然而，研究人员得出结论，GPX4抑制诱导的铁死亡不需要线粒体功能，这表明线粒体在铁死亡中的作用是环境依赖性的，这与在 Gpx4-/- 原代细胞中的观察结果一致。值得注意的是，敲除小鼠中的Gpx4对于胚胎来说是致命的，而条件性 Gpx4 缺失会促进大脑、肝脏、内皮、造血系统和免疫系统的紊乱。在哺乳动物细胞中，GPX4 的几种亚型，包括细胞溶质和线粒体亚型，均由单个基因编码。由于在其氨基末端存在线粒体靶向信号，GPX4 的线粒体同种型被认为定位于线粒体中。然而，除了精细胞外，这种同种型可能不会在大多数细胞类型中内源性表达。细胞溶质 GPX4 亚型可以穿过线粒体外膜并在膜间隙积聚，有助于抑制线粒体脂质过氧化。体内证据也支持线粒体在铁死亡中起重要作用的观点。线粒体靶向抗氧化剂 MitoTEMPO 已被证明可以防止铁死亡引起的心脏损伤。此外，缺乏线粒体铁蛋白的小鼠在脑损伤后会出现更严重的脑损伤和神经功能缺损，以及更典型的铁死亡特征，如脂质过氧化增加和谷胱甘肽抗氧化防御障碍，而线粒体铁蛋白的过表达抑制铁死亡并阻止这些病理变化。2021 年发表的一项研究描述了一种针对铁死亡的新型线粒体防御机制。通过分析全球代谢组学数据，研究人员将酶二氢乳清酸脱氢酶（醌）、线粒体（DHOH）与体外铁死亡联系起来。DHODH位于线粒体内膜，在那里它催化嘧啶从头合成途径中的限速反应第四步，将二氢乳清酸转化为乳清酸。有趣的是，在 GPX4 低表达的癌细胞中删除 DHODH 可增加线粒体脂质过氧化和铁死亡。此外，将 GPX4 递送至线粒体可抑制 DHODH 缺陷细胞中 RSL3 诱导性铁死亡的发生。SLC25A39 已被确定为线粒体谷胱甘肽输入源，突出了其在调节线粒体脂质过氧化和铁死亡细胞死亡中的潜在功能作用。然而，目前还需要更多的研究来确定 DHODH 的体内功能并确定其他调节铁死亡的线粒体酶，特别是在心脏保护方面（图 3）。

图3. 线粒体在铁死亡中的调节作用。线粒体拥有广泛的关键代谢过程（例如三羧酸 (TCA) 循环），并且是活性氧 (ROS) 的主要来源。已经进化出独立的线粒体定位防御系统来防止线粒体脂质过氧化和铁死亡。例如，线粒体型的磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶 4 (GPX4) 或二氢乳清酸脱氢酶 (醌)，线粒体 (DHODH) 可以特异性地对线粒体脂质过氧化物进行解毒。此外，线粒体特异性形式的铁蛋白 (FTMT) 保护线粒体免受铁过载引起的氧化损伤，mitoNEET（也称为 CISD1）通过限制线粒体铁摄取来抑制铁死亡。CoQ10, coenzyme Q10 辅酶Q10; FPN, ferroportin 铁转运蛋白; FSP1, ferroptosis suppressor protein 1 铁死亡抑制蛋白 1; GSH, glutathione 谷胱甘肽; GSSG, glutathione disulfide 谷胱甘肽二硫化物; HO1, haem oxygenase 1 血红素加氧酶1; LIP, labile iron pool 不稳定铁池; PL-PUFA-OOH, polyunsaturated fatty acid-containing phospholipid hydroperoxides 含多不饱和脂肪酸的磷脂氢过氧化物; PLOO·, phospholipid peroxyl radical 磷脂过氧自由基; RNF217, E3 ubiquitin protein ligase RNF217 E3泛素蛋白连接酶RNF217; SLC25A39, probable mitochondrial glutathione transporter SLC25A39 可能的线粒体谷胱甘肽转运蛋白 SLC25A39; SLC39A14, solute carrier family 39 member 14 溶质载体家族 39 成员 14; TF, transferrin 转铁蛋白; TFR1, transferrin receptor protein 1 转铁蛋白受体蛋白 1。

调节铁死亡的其他途径

铁死亡抑制蛋白 1 (FSP1) 已被两项独立的研究确定为不依赖谷胱甘肽的抗铁死亡因子。在豆蔻酰化后，FSP1 被募集到质膜，在那里它作为一种氧化还原酶使用 NADPH 催化辅酶 Q10的产生。辅酶 Q10通过其在细胞膜中的抗氧化特性作为铁死亡的内源性抑制剂发挥作用，通过角鲨烯合酶羟戊酸途径消耗辅酶 Q10这一过程（至少部分）解释了 3 型铁死亡诱导剂 Fin56 促进铁死亡的机制。尽管先前在小鼠中进行的一项研究表明，多柔比星可以通过心脏中的脂质过氧化产物激活 FSP1 易位，但 FSP1 在心脏中的确切功能仍然知之甚少。因此，具有条件 Fsp1 敲除的小鼠可能是提供进一步机制探索的潜在工具。

心血管疾病中的铁死亡

早在 2014 年发现 GPX4 是铁死亡的关键调节因子之前，就已经有大量研究提供了一些初步证据，表明 GPX4 改变在非凋亡形式细胞死亡中起到作用。例如，小鼠中进行完全 Gpx4 敲除在胚胎第 7.5 天时是致命的，而成年小鼠中 Gpx4 的诱导性敲除导致体重迅速下降并在 2 周内死亡。此外，内皮细胞条件性 Gpx4 敲除的小鼠通常会因为缺乏维生素E导致的血栓栓塞事件而在 3 周内死亡。这种由 GPX4 和维生素 E 缺乏症共同导致的表型表明 GPX4 在心血管生理学中的重要作用。然而，仍然缺乏证据支持 Gpx4 敲除动物模型中存在铁死亡。

心肌缺血再灌注损伤

缺血再灌注损伤是一种相当常见的危及生命的临床并发症，可以发生在包括心脏、肝脏、肾脏和大脑在内的几乎任何器官。据报道，早在铁死亡的概念首次确立之前，GPX4 的线粒体特异性过表达就被发现在缺血再灌注损伤后具有心脏保护作用。2014年，两项研究发现，铁死亡是肾脏和肝脏缺血再灌注损伤的主要驱动因素。随后的一项研究表明，通过抑制谷氨酰胺分解来抑制铁死亡可减少离体心脏模型中的缺血再灌注损伤。进一步的体内数据提供了额外的证据，表明在急性和慢性心肌缺血再灌注损伤期间抑制铁死亡或螯合铁可以提供心脏保护益处，突出了靶向铁死亡作为缺血再灌注损伤的有希望的新治疗策略的潜力。心脏移植后的缺血再灌注损伤可导致严重并发症，例如原发性移植物功能障碍和死亡风险增加。除了心肌细胞的直接损失外，铁死亡诱导的缺血再灌注期间内源性物质的释放可通过 Toll 样受体 4依赖的信号通路促进中性粒细胞与冠状血管内皮细胞的粘附，从而引发供体心脏中有害的炎症反应。重要的是，通过分析氧化脂质组学，氧化的磷脂酰乙醇胺也被鉴定为铁死亡的特定产物，为心脏中的铁死亡提供了直接证据。在从患有缺血再灌注损伤的心脏分离的线粒体中也发现了铁死亡的氧化磷脂酰乙醇胺种类的积累，进一步突出了心脏线粒体在脂质过氧化物的产生和铁死亡信号传导中的作用。此外，2021 年开发了一种新的成像方案，可以直接检测特定细胞和组织中氧化磷脂酰乙醇胺的存在和分布。该方法在前临床研究中的应用将有助于推动各种疾病状态（包括心血管疾病）中的过氧化脂质的检测。

蒽环类药物的心脏毒性

如上所述，多柔比星治疗恶性肿瘤的应用受到其心脏毒性作用的限制。我们的研究小组通过测量各种细胞死亡抑制剂对多柔比星治疗小鼠存活率的影响，研究了各种形式的受调节细胞死亡在多柔比星诱导的心脏毒性中的相对贡献，并表明抑制铁死亡具有心脏保护作用。除了诱导心脏损伤外，阿霉素治疗还导致心脏铁水平、脂质衍生的 ROS 和铁死亡生物标志物的强烈增加。总之，这些发现表明，铁死亡在多柔比星诱导的心肌病和死亡中起主要作用。此外，在亚细胞水平上，我们发现线粒体是 HO1 介导的游离铁释放的靶点，这会导致线粒体膜中的脂质过氧化。随后于 2020 年发表的一项研究证实，线粒体依赖性铁死亡在多柔比星诱导的心脏毒性中具有主要致病作用。具体来说，该研究表明，阿霉素治疗可以下调心脏中 GPX4 的表达，导致过度的脂质过氧化。此外，小鼠中 GPX4 的过表达可预防多柔比星诱导的心肌病，而敲除 Gpx4 会加剧多柔比星诱导的心肌病。然而，阿霉素治疗下调 GPX4 的机制需要进一步阐明。最后，值得注意的是，在培养的心肌细胞中驱动阿霉素诱导的心脏毒性的是caspase依赖性细胞凋亡而不是铁死亡。体内和体外研究结果之间的这种明显差异反映了多柔比星体内作用机制的复杂性。例如，与体内环境相比，培养细胞中的 HO1 通路受到不同的调节，从而影响铁积累和脂质过氧化。

糖尿病性心肌病

糖尿病是心血管疾病患者的常见合并症，可增加心脏对缺血再灌注损伤的易感性。因此，糖尿病的患者发生急性心梗预后更差。糖尿病可以通过以 AMPK 依赖性方式激活 NADPH 氧化酶途径，从而加重心肌缺血再灌注损伤，随后诱导各种形式的程序性细胞死亡，包括铁死亡。在 1 型糖尿病的链脲佐菌素小鼠模型中，铁死亡已被证明在介导心肌缺血再灌注损伤中具有致病作用。此外，高血糖诱导的内质网应激似乎与铁死亡介导的心肌细胞损伤有关。糖尿病患者发生与冠状动脉疾病和高血压无关的心肌功能障碍的风险也增加——这种现象被称为糖尿病性心肌病。事实上，包括氧化应激在内的几种致病因素已被证明有助于糖尿病心脏的结构和功能变化。在 2022 年发表的一项研究中，首次报道了糖尿病小鼠心脏中的铁死亡，其中 NRF2 激活被证明可以通过上调铁蛋白和 SLC7A11 水平来预防铁死亡。

脓毒症引起的心脏损伤

脓毒症引起的心脏损伤和功能障碍与患者死亡率增加相关。盲肠结扎和穿刺是目前研究脓毒症最常用的动物模型，涉及穿孔盲肠以使粪便物质释放到腹膜腔中，从而触发由多种微生物感染介导的免疫反应。盲肠结扎和穿刺已被证明可增加心脏铁含量和脂质过氧化水平，以及降低心脏谷胱甘肽含量和 GPX4 表达，这表明脓毒症引起的心脏损伤的发展可能涉及铁死亡。此外，铁死亡已被证明在脂多糖诱导的脓毒性心肌病模型中起作用。脂多糖诱导的心脏线粒体膜中铁黄素 1 表达增加可增加线粒体 ROS 的产生，导致铁死亡的发生。

肥厚型心肌病

在心脏中，压力超负荷（由于肺动脉高压和/或全身性高血压）可导致心脏肥大、心脏纤维化和最终的心力衰竭。主动脉束带或异丙肾上腺素给药后，动物模型中心脏 NADPH 氧化酶 4 表达增加和心脏 GPX4 活性降低，表明ROS 产生和铁死亡可能参与从代偿性肥大到心力衰竭的进展过程。在小鼠中，发现关键的铁死亡调节因子 SLC7A11 的基因缺失会加剧血管紧张素 II 介导的心脏纤维化、肥大和功能障碍，这提供了铁死亡参与肥厚型心肌病的遗传证据。有趣的是，已有研究显示，心肌细胞中特异性 Ncoa4 的基因缺失，可通过抑制铁蛋白吞噬来减轻横向主动脉缩窄 (TAC) 诱导的心力衰竭。此外，铁死亡抑制剂减弱了接受 TAC 的野生型小鼠的心脏重塑，但没有为 Ncoa4 敲除小鼠提供额外的保护，这表明心脏铁死亡是 NCOA4 介导的铁蛋白吞噬的下游结果。此外，在 TAC 小鼠模型中，混合谱系激酶 3（也称为 MAP3K11）已被证明可诱导细胞焦亡和铁死亡，这对于 TAC 介导的心肌纤维化的发展至关重要。然而，各种形式的细胞死亡参与肥厚型心肌病发病机制的机制仍有待确定。

铁死亡和心律失常之间的推定联系

心律失常在心力衰竭患者中很常见。一项前临床研究的结果表明，铁死亡和心律失常之间可能存在联系。在小鼠中，频繁过量饮酒会引发铁死亡并增加心房颤动的可诱发性。铁死亡抑制剂可以部分或完全逆转过量饮酒引起的大部分不良变化。如上所述，铁死亡可以波状方式传播到相邻的细胞，这种现象尚未被报道可在其他形式的可调节性细胞死亡中发生。然而，这种看似定向的传播模式背后的机制仍然未知。心脏组织是协调肌肉收缩的功能性合体，主要通过间隙连接通道介导的细胞间电化学耦连实现对心脏节律的调控，这也为铁死亡的波状传播提供了基础。因此，心肌可能是研究细胞死亡传播的理想模型。有趣的是，心肌损伤（如缺血再灌注损伤）通常会导致心律失常以及坏死区的形成，这被认为是铁死亡细胞间传播的原因。因此，有必要进一步研究铁死亡的这一特征。

其他心血管相关疾病

镰状细胞病是一组遗传性红细胞疾病，其特征是存在导致器官缺血和心血管并发症的溶血。镰状细胞病小鼠血红素水平升高导致心脏 HO1 水平上调，进而促进心脏中的铁过载、脂质过氧化和铁死亡。此外，抑制和诱导铁死亡分别减弱和加剧了与镰状细胞病相关的心肌病。目前，全球人口正处于 2019 年新型冠状病毒肺炎 (COVID-19) 疫情之中，该疾病是一种由严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 引起的呼吸道感染。研究人员已经很好地了解了与 COVID-19 相关的心血管并发症。铁也可能在 COVID-19 的发病机制中发挥重要作用，因为估计 90% 的入院患者血清铁水平异常，而这些水平与疾病严重程度相关。基于这些观察，铁死亡已被提出可作为治疗 COVID-19 的潜在靶点。研究显示心脏中的原发性起搏细胞在感染 SARS-CoV-2 后会出现与铁死亡相关的心功能障碍。此外，高通量化学筛选表明，酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼和铁螯合剂去铁胺可以阻断 SARS-CoV-2 感染和相关的铁死亡。

铁死亡是一个极具前景的治疗靶点

鉴于其在心脏病发病中的作用，铁死亡是治疗和预防心血管疾病的一个非常有前景的治疗靶点。本节总结了各种抑制铁死亡途径的小分子，并讨论了这些分子在各种心脏病模型中的用途（表 3）。

表3. 铁死亡相关疾病中小分子调节剂的总结。AMPK, AMP-activated protein kinase; ER, endoplasmic reticulum 内质网; GPX4, glutathione peroxidase 4 谷胱甘肽过氧化物酶4; HO1, haem oxygenase 1 血红素加氧酶1; I–R, ischaemia–reperfusion 缺血-再灌注; NOX2, NADPH oxidase 2 NADPH氧化酶2; NRF2, nuclear factor-erythroid 2-related factor 2; ROS, reactive oxygen species 活性氧; TAC, transverse aortic constriction; TFR1, transferrin receptor 1 转铁蛋白受体1。

Ferrostatin 1、liproxstatin 1 和抗氧化剂

Ferrostatin 1 是第一代 ferroptosis抑制剂。自从首次报道这种小分子化合物的抗铁死亡作用以来，ferrostatin 1 已在包括心血管疾病在内的多种疾病中进行了测试。我们小组率先在患有实验性心肌病的小鼠中使用 ferrostatin 1，并发现它可以在不影响铁水平的情况下预防阿霉素引起的心脏损伤。随后的一项研究表明，ferrostatin 1 还可以防止培养的心肌细胞中阿霉素诱导的细胞死亡。此外，在急性或慢性心肌缺血再灌注损伤以及糖尿病小鼠的动物模型中，ferrostatin 1 已被证明可以改善心脏功能。在心脏移植的小鼠模型中，ferrostatin 1 治疗阻止了心肌细胞死亡后中性粒细胞的募集，表明这是一种改善接受心脏移植患者临床结果的潜在策略。此外，据报道，ferrostatin 1 治疗可减轻小鼠败血症引起的心肌病和动脉粥样硬化。值得注意的是，一些研究人员指出，ferrostatin 1 的体内功能弱于其体外功能，因为它在血浆中的稳定性较低。为了解决这个问题，一种名为 UAMC-3203 的可溶性 ferrostatin 类似物被开发为比 ferrostatin 1 更稳定、更有效的铁死亡抑制剂。在动物中，UAMC-3203 在预防铁死亡驱动的多器官功能障碍方面优于 ferrostatin 1，因此可能是一种合适的临床研究的候选药物。Liproxstatin 1 是一种螺喹喔啉衍生物，首次通过 Gpx4-/- 细胞的高通量筛选被鉴定为铁死亡的特异性抑制剂。Liproxstatin 1 在心血管病理生理学方面的研究不如 ferrostatin 1，但一项小鼠研究表明，liproxstatin 1 可以通过减少线粒体ROS的产生以及维持 GPX4 活性来保护心肌免受缺血再灌注损伤。随后的一项研究发现，liproxstatin 1显著降低了棕榈酸诱导的心脏损伤，具有与 ferrostatin 1 相似的保护作用。在心血管疾病中，其他常用的抗氧化剂是 2,2,6,6-四甲基哌啶基-1-氧基 (TEMPO) 和 MitoTEMPO，MitoTEMPO是一种线粒体靶向版本的 TEMPO，旨在清除线粒体超氧化物。我们之前已经证明，MitoTEMPO 可以有效地预防多柔比星诱导的小鼠脂质过氧化、心脏铁死亡和心功能不全，而 TEMPO 仅能轻度降低这些多柔比星诱导的影响。这些发现有力地支持了线粒体脂质过氧化和心脏铁死亡以协调的方式介导多柔比星诱导的心肌病的观点。鉴于铁死亡只是导致心肌细胞死亡的一种途径，针对铁死亡和坏死性死亡的联合策略可能更有效地控制心脏病。Nec-1f 是一种双重抑制剂，主要针对受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 1 和主要在肾细胞和肾小管中的铁死亡，可显着提高心脏移植小鼠模型和肾缺血再灌注损伤小鼠模型的存活率。

铁螯合剂和铁螯合疗法

鉴于铁死亡是一种铁依赖性的程序性细胞死亡模式，铁螯合可以抑制铁死亡也就不足为奇了。铁螯合剂右雷佐生是目前唯一获得 FDA 批准的用于预防多柔比星引起的癌症患者心脏毒性的药物。右雷佐生是乙二胺四乙酸的环状衍生物，可轻松穿过细胞膜并螯合细胞内游离铁。一项研究表明，抑制铁死亡是右雷佐生发挥其心脏保护作用的主要机制。然而这一发现也引出了一个问题，即为什么其他铁螯合剂似乎对多柔比星诱导的心脏损伤无效。研究人员认为，右雷佐生可以直接进入心肌细胞中的线粒体并减少铁的积累，而其他铁螯合剂不能进入线粒体。MitoFerroGreen 是一种新的线粒体特异性铁螯合剂，可为阿霉素处理的小鼠提供心脏保护，这一发现进一步支持了这一观点。此外，其他铁螯合剂（如去铁酮和去铁胺）已被证明可以通过阻断铁死亡来减轻心肌缺血再灌注损伤和脓毒症相关的心脏损伤。然而，值得注意的是，铁螯合剂可以保护组织免受损伤的发现并不一定表明它是通过抑制铁死亡来实现的。

GSH 前体

半胱氨酸是通过system xc-输入的胱氨酸的还原形式，是谷胱甘肽生物合成中的限速前体物，在体外细胞培养基中添加胱氨酸或半胱氨酸已被证明可以抑制铁死亡。抗氧化剂 N-乙酰半胱氨酸 (NAC) 正是被研发出来的用于提高半胱氨酸的生物利用度，并已被证明对心血管功能具有有益作用。NAC的抗铁死亡作用已在半胱氨酸消耗和system xc-抑制诱导的铁死亡的情况下得到证实。NAC 治疗也被证明可以减少糖尿病大鼠的心肌缺血再灌注损伤，这表明这种化合物可能在心脏病中具有临床应用价值。

其他影响心脏铁死亡的化合物

除上述药物外，其他化合物还可以通过作用于其他靶点来抑制心脏铁死亡。例如，锌原卟啉 IX 是一种 HO1 的竞争性抑制剂，可通过阻断血红素降解和由此产生的游离铁释放来减少多柔比星诱导的小鼠心脏铁积累和铁死亡。谷氨酰胺分解是半胱氨酸剥夺诱导的铁死亡所必需的，化合物 968 是一种可渗透细胞的谷氨酰胺分解小分子抑制剂，已显示可通过限制谷氨酰胺水平来减轻离体心肌缺血再灌注损伤。此外，P22077作为一种泛素特异性蛋白酶 7 的抑制剂，已被证明通过激活 p53 和降低 TFR1 水平来抑制铁死亡，从而提供对心肌缺血再灌注损伤的保护。有趣的是，右美托咪定（一种临床上用于镇静患者的 α2-肾上腺素能受体激动剂）已被证明可通过铁死亡抑制因子 GPX4减轻脓毒症引起的心肌损伤。此外，葛根素是一种从葛根中提取的异黄酮，已被证明可以防止培养的心肌细胞中的erastin 诱导和异丙肾上腺素介导的铁死亡，并且可以减轻大鼠压力超负荷引起的心力衰竭。阿托伐他汀也被证明可以通过抑制铁蛋白吞噬介导的铁死亡，来改善异丙肾上腺素诱导的小鼠心脏功能障碍和重塑，从而为预防肥厚型心肌病提供另一种潜在的治疗策略。最后，常用的心脏药物可能具有以前未知的抗铁死亡活性。例如，广泛用于治疗高血压和心力衰竭的卡维地洛已被证明可阻断铁死亡，并且这种能力与它对 β-肾上腺素能受体的影响无关，其潜在机制赋予了其清除脂质过氧化物和螯合铁的能力。

越来越多的证据支持铁死亡在各种心血管疾病的发生和发展中起到作用。然而，在临床评估铁死亡靶向药物的治疗潜力之前，仍有许多问题亟待解决。首先，防止心脏铁死亡的关键保护机制是什么？其次，我们能否鉴别出可靠的生物标志物来预测心血管疾病中的铁死亡？目前在临床前研究中使用的铁死亡生物标志物是非特异性的，在其他类型的细胞死亡和某些病理状况中均可存在。在这个快速发展的领域里，缺乏铁死亡特异性生物标志物一直是限制铁死亡靶向临床应用发展的长期瓶颈。第三，是否有可能设计出有效的铁死亡靶向策略来预防和治疗与铁死亡相关的心血管疾病？最后，在心血管疾病的发展过程中，其他形式的细胞死亡何时以及如何与铁死亡一起发生？尽管在多种动物模型中已显示选择性抑制铁死亡可显着改善心脏功能，但迄今为止尚未有临床试验使用铁死亡特异性抑制剂治疗心血管疾病。迫切需要更多基于人群的数据，来确定选择性阻断铁死亡是否可以改善临床环境中的心血管结局。

在30年前就已经有人提出铁与心血管疾病之间的联系，但这种关系背后的机制途径一直难以捉摸，直到 10 年前铁死亡（一种依赖铁的调节性细胞死亡形式）被发现。铁死亡是由铁依赖性脂质过氧化的激活引起的，但参与该过程的关键效应分子尚不清楚。过量的游离反应性铁会导致组织损伤，铁螯合疗法已被广泛推荐用于治疗与铁过载相关的心肌病患者。临床前研究正在努力为研发可用于临床试验的有效铁死亡特异性拮抗剂打下基础。　　1HO1的一般生物学特性与功能

HO1也称之为热休克蛋白32（HSP32），是目前研究最多的一种同工酶。相对分子质量为32000，染色体定位22q12，在细胞中定位于微粒体，诱导性表达于肝、脾、心、肺、血管平滑肌、脑等组织，诱导因素为应激、缺氧、内毒素、过氧化氢、重金属、紫外线、细胞因子、生长因子等。作为血红素降解的限速酶，HO1降解由衰老或破损的红细胞释放出血红素，首先生成胆绿素、一氧化碳(CO)和Fe2+，然后胆绿素在胆绿素还原酶作用下转换成胆红素，Fe2+诱导并参与了体内铁蛋白的合成。在血红素降解过程中需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）供氢并消耗O2。以往认为血红素代谢产物不仅对机体无益，过量时还可对机体造成损害。如游离胆红素如果不能和葡萄糖醛酸充分结合并排出体外，就容易透过血脑屏障对神经系统造成损伤；Fe2+可产生活性羟基引起严重的氧化应激，导致细胞膜损坏和组织的损伤[3]；而CO和血红蛋白结合后可造成组织缺氧。随着研究深入，人们对HO1及其催化产物在机体中的作用有了更深入的了解。首先HO1分解血红素，避免了血红素对细胞的损伤，催化过程中消耗了O2，减少了氧自由基生成。其次HO1的催化产物铁蛋白、CO、胆红素在氧化应激中起着保护组织细胞的作用，其中铁蛋白可降低细胞内Fe2+的浓度[4]，同时HO1还可以上调内质网上的Fe2+通道，促进细胞内Fe2+泵出[5]，防止由Fe2+介导的氧化应激损伤；胆红素作为HO1的代谢产物，能有效地清除氧自由基，防止细胞脂质层过氧化，而且游离胆红素比结合胆红素更能有效地抑制低密度脂蛋白分解[6]；CO可以促使血管舒张，其机制为CO和NO一样可以活化鸟甘酸环化酶，使三磷酸鸟嘌呤核苷（GTP）转化成环磷酸鸟甙（cGMP），使血管舒张；CO还可以通过刺激平滑肌细胞膜上的K+通道促使血管舒张，以及抑制缩血管内皮素(ET1)的释放所引起的血管收缩[7]。另外，CO还通过鸟甘酸环化酶活化P38有始分裂原活化MAPK信号转导途径，既可抑制炎症因子的基因表达，又可促进抗炎因子的产生来抑制炎症反应[8]。除此以外，CO还有防止血管平滑肌细胞过度增生、抗血小板聚集、抗凋亡等作用。

2HO1的诱导与表达

调控HO1可以被许多不同种类的因素所诱导，这些因素的共同特点是都能引起氧化应激，并通过有丝分裂原活化MAPK、蛋白激酶C、cAMP依赖性蛋白激酶A、cGMP依赖性蛋白激酶G等不同的信号途径来诱导HO1基因表达。研究表明，HO1基因表达调控主要在转录水平上，HO1启动子区域包含不同的顺式反应元件,包括激活蛋白1(AP1)结合位点、金属反应元件、抗氧化反应元件、热休克和血红素反应元件等，转录因子如氧化应激反应转录因子NFκB和AP1等与这些特殊元件结合可导致HO1基因激活。但HO1基因调控在不同细胞种类和物种之间有很大差异，如在大鼠HO1的启动子上有热休克反应元件，热休克可促使热休克核因子聚集到相应的基因片段使HO1基因稳定。但在人类，两者结合则会引起HO1基因的表达[9]。目前研究最多的转录因子是激活蛋白因子1（AP1）家族，其中NFE2相关因子2（Nrf2）最为重要。Nrf2可以和HO1基因抗氧化反应片段结合，调节相关基因，在氧化应激细胞反应中起重要作用。动物试验证实在小鼠HO1基因的增强区有一10bp序列，被称为应激反应元件（StRE），对于缺氧以外各种因子引起的应激反应非常重要，StRE中包含了AP1家族结合位点，两者结合可诱导HO1基因表达，而StRE突变会使HO1基因在应激状况下不能被活化，显示了AP1蛋白在HO1基因表达调控中的作用。其他转录因子如低氧诱导因子1（HIF1），在与HO1基因相应片段结合后可诱导缺氧状况下的HO1基因表达[10]。HIF1在含氧量正常情况下也可被一些受体介导因子如生长因子、细胞因子所诱导，但效应远低于低氧因素，低氧可以通过MAPK或磷脂酰肌醇3激酶信号通道介导HIF1蛋白合成[11]。

3HO1与心血管系统

3．1HO1与冠状动脉疾病（CAD）早在1994年Schwertner等[12]第一次发现了血浆中胆红素的浓度与CAD的发病率成显著负相关，这个重要发现提示血浆中的胆红素浓度低于正常可能会导致缺血性心脏疾病的发生。随后，Hopkins等也注意到有家族性CAD的病人血浆中的胆红素浓度明显低于无家族史的病人。Hunt等进一步证实遗传性胆红素浓度降低病人早期易患CAD。另外人们发现胆红素血浆浓度与许多CAD的危险因素如吸烟、低密度脂蛋白、糖尿病、肥胖呈负相关，与CAD保护性因素高密度脂蛋白呈正相关。但即使消除了CAD的危险因素，胆红素血浆浓度降低仍易导致CAD,表明了血浆中的胆红素浓度直接与CAD相关。CAD与氧自由基生成、脂质过氧化、动脉粥样硬化以及炎症有关[1314]。血管动脉粥样硬化主要是因为低密度脂蛋白氧化并被内皮巨噬细胞吞噬后形成了富含脂质的泡沫状细胞。而胆红素能防止脂蛋白特别是低密度脂蛋白氧化，从而阻止动脉粥样硬化斑块形成。同时胆红素能清除氧自由基和与炎症有关的过氧化氢，保护心肌细胞膜免受氧化损伤。HO1还可通过其他途径来影响CAD的发生。如HO1分解血红蛋白（Heme），减少了Heme对心肌细胞的氧化损伤；产生的CO可通过活化鸟甘酸环化酶增加平滑肌细胞内的cGMP，使冠脉平滑肌舒张，还可抑制血小板聚集和血管平滑肌增生；HO1促使铁蛋白合成增加也消除了由细胞内铁引起的细胞损伤和慢性炎症。总之，HO1及其代谢产物可通过不同的途径降低CAD发病的危险性。

3．2心脏缺血再灌注损伤随着心脏移植、体外循环、冠脉搭桥、冠脉介入治疗应用于临床，缺血再灌注损伤已引起医学界的高度重视。动物实验显示，氧自由基、钙超载、心肌纤维能量代谢障碍、血管内皮细胞、一氧化氮、中性粒细胞、细胞黏附分子和细胞凋亡等均可能参与再灌注损伤的发病过程。而HO1作为抗氧化应激的蛋白酶，它在心肌缺血及随后的再灌注损伤中的作用也越来越受到人们关注。Clark等[6]发现在心肌缺血前24h用氯高铁血红素(HO1诱导剂)预处理，再灌注后心肌功能较对照组有显著改善，而且在HO1高表达的区域，线粒体完整性保存较好，心肌梗死面积明显缩小。氯高铁血红素预处理是否影响其他热休克蛋白（HSP）的水平或触发其他的心肌保护机制还缺乏试验证实，但用HO1抑制剂后即使再用氯高铁血红素预处理，心肌缺血再灌注损伤依然没有加重[15]，表明HO1与心肌缺血再灌注损伤程度有直接联系。同样，Vulapalli等研究HO1在缺血再灌注心肌保护中的作用时发现，在心肌细胞中选择性表达HO1的转基因小鼠能有效防止缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡，而且HO1高表达并没有影响到其他细胞保护性基因如HO2、HSP90的表达，这进一步证实了HO1在缺血再灌注中直接的心肌细胞保护作用。除了HO1在催化中消耗O2，减少了氧自由基形成以及HO1的催化产物胆红素的抗细胞氧化作用外，对于HO1催化产物CO在缺血再灌注损伤中的保护作用，Yet等[16]发现CO可以阻止炎性细胞浸润，减少炎性渗出。作用机制可能是CO抑制细胞间黏附因子1(VCAM1)、血管细胞黏附因子1（ICAM1）基因的表达，阻碍了中性粒细胞在血管壁上的黏附、渗出和浸润，减少了炎性反应对心肌细胞的损害。CO舒张血管作用提高了再灌注心肌的血流，也可以减轻再灌注心肌的损伤。心肌缺血再灌注引起的氧化和炎症反应必然会导致心肌细胞的坏死和凋亡而造成心肌功能损害。Soares等[17]证实HO1过度表达可以抑制由肿瘤坏死因子（TNFα）引起的内皮细胞凋亡。Vulapalli等[18]的试验结果也证实了HO1的抗调亡作用，但抗调亡机制尚不清楚，推测除了HO1的催化产物胆红素和CO的抗氧化、抗炎作用抑制了引起细胞凋亡的因素外，HO1还促进抗凋亡基因Bcl2、抑制促凋亡基因caspase3的表达，提示HO1与凋亡相关基因之间的传导途径可为减轻缺血再灌注所造成的心肌损伤提供更有效的方法。

3．3心肌重构以往人们认为心肌重构是由血压或容量负荷增加引起心室壁应力的适应性变化，包括心肌细胞体积增大，心肌胶原蛋白合成增加。尽管开始是一种心脏功能代偿机制，但病理性心脏肥大逐渐发展最终会导致充血性心力衰竭。在心脏重构过程中，心肌不断对细胞外刺激如机械应激、缺血、氧自由基、生长因子、血管活性肽、激素等作出反应，心肌细胞体积不断增大，胶原蛋白合成增加最终导致心力衰竭。有研究人员发现，HO1过表达能减轻Wister大鼠由血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）引起的心肌肥厚，但不能缓解由AngⅡ引起的高血压[19]。这个发现提示AngⅡ引起的心肌重构可能并非直接继发于AngⅡ引起的高血压，HO1可能直接作用于心肌组织而非通过血压调控机制来减轻心肌重构。Hu等认为由AngⅡ诱导产生的活性氧簇作为刺激心肌生长的信号分子而非由AngⅡ引起的血压增高，在心肌重构中起了主要作用。而HO1的催化产物胆红素清除活性氧和抗氧化作用，可以抑制活性氧簇引起的心肌重构。这种假设和早期研究抗氧化可以抑制心肌重构的试验结果相吻合。总之，活性氧被认为是一种生长刺激因素的信使，明确活性氧在心肌重构时的传导途径，用HO1作为基因治疗手段，可以为临床治疗心脏损伤后的心肌重构提供一种新的方法。

4小结与展望

HO1性质、功能与调控已日益引起人们的关注。大量研究表明HO1对氧化损伤所引起多种疾病具有保护作用。HO1催化血红素降解的3个产物CO、胆红素和铁蛋白是发挥细胞保护作用的关键分子。虽然每个产物独自作用时都有保护作用，但是细胞保护作用主要是三者协同作用的结果。当应激发生时，适量HO1的诱导产生，能维护细胞自身稳定，实现对细胞的保护。目前加拿大研究人员利用经改造过的病毒为载体，把额外的HO1基因副本释放到实验鼠的心脏组织，使其在缺血、缺氧情况下能迅速地制造出大量的HO1蛋白，以减轻心脏病发作对心肌的损伤。目前对HO1的研究已有很大进展，但HO1的分子结构、催化反应机制、调控系统尚未得到很好了解，有待进一步探索；3种降解产物之间的相互作用关系还知之甚少。进一步探索HO1以及血红素催化产物的细胞保护机制、HO1生成量调控已成为下一步研究的重点。相信在不久的将来，HO1将会成为一种有效的治疗药物应用于临床。

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